همسانه سازی و بیان ژن fsh گوسفندی در مخمر pichia pastoris

هورمون محرک فولیکول، پروتئینی دوبخشی است که از زیر واحد آلفا و بتا تشکیل شده است. این دو زیر واحد با پیوند غیر کووالانسی به هم مرتبط هستند. هورمون fsh نقش مهمی در تنظیم بلوغ تخمک بازی می کند و یک عنصر کلیدی برای رشد فولیکول در تخمدان میش می باشد. هدف این مطالعه کلون و بیان زیر واحدهای هورمون محرک فولیکول گوسفندی در مخمر pastoris pichia است. برای این منظور ژن های دو زنجیره آلفا و بتا fsh گوسفندی از طریق استخراج rna از سلول های هیپوفیز قدامی گوسفندی جداسازی و cdna آنها ساخته شد. با کمک پرایمرهای اختصاصی ژن، ناحیه orf هر دو زنجیره تکثیر و در وکتور ptz57r/t کلون شدند. سپس ژن نوترکیب در وکتور بیانی pic9 ساب کلون و توالی یابی شد. پس از کشت سلول های مخمر، وکتور نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و وکتور نوترکیب حاوی زنجیره بتا به روش الکتروپوریشن به درون سلول مخمر p. pastoris کوترانسفکت شدند. بیان پروتئین نوترکیب با القا متانول 5/0 درصد حجم کل در هر 24 ساعت صورت گرفت. صحت قرار گیری ژن fsh در ژنوم مخمر توسط pcr با پرایمرهای aoxi و پرایمرهای اختصاصی ژن بررسی شد. در نهایت، حضور ژن fsh گوسفندی توسط sds-page و وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت. در نتیجه بیان هورمون نوترکیب fsh گوسفندی با پپتید نشانه آلفا فاکتور- پپیتید نشانه طبیعی ژن در میزبان مخمر متیلوتروفیک پیکیا پاستوریس امکان پذیر است. بنابراین این سیستم یک میزبان قابل اعتماد برای تولید fsh گوسفند است.